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文章名稱：Lung metastasis and recurrence is mitigated by CAR macrophages, in-situ-generated from mRNA delivered by small extracellular vesicles

中文名稱：由小型細(xì)胞外囊泡遞送mRNA在體內(nèi)生成的CAR巨噬細(xì)胞可顯著抑制肺癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)

雜志名：nature communications

期刊影響因子：15.7

第一作者：Yuchen Xiao, Tianchuan Zhu

通訊作者：Xi Huang

發(fā)表日期：2025.8.4

https://doi.org/10.1038/s41467-025-62506-2

研究內(nèi)容

概述：

本文設(shè)計(jì)了一種吸入式的納米遞送系統(tǒng)：

把編碼CAR（靶向間皮素）的 mRNA 放到小型細(xì)胞外囊泡（sEV）里，并在囊泡表面裝上能識別 M2 型巨噬細(xì)胞表面受體 CD206 的單鏈抗體片段。

這樣吸入后，這些帶有識別標(biāo)記的囊泡會在肺里累積，并被M2 巨噬細(xì)胞攝取。囊泡里的mRNA 在巨噬細(xì)胞內(nèi)被翻譯為 CAR 蛋白，從而把這些巨噬細(xì)胞改造為有抗腫瘤吞噬能力的 CAR-M。

與體外培養(yǎng)再回輸?shù)募?xì)胞療法相比，這種原位（in-situ）生成 CAR-M 的方式，避免了復(fù)雜的細(xì)胞制造過程，并減少了全身給藥導(dǎo)致的肝臟富集問題。

動物實(shí)驗(yàn)表明：吸入給藥能減少肺轉(zhuǎn)移腫瘤量、延長生存，并促進(jìn)免疫記憶，能有效抑制腫瘤復(fù)發(fā)。

研究背景

腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因。肺是常見的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)，傳統(tǒng)的CAR-M（嵌合抗原受體改造的巨噬細(xì)胞）在治療實(shí)體瘤上前景不錯，但面臨制造復(fù)雜，以及靜脈注射后主要在肝臟累積以至肺可達(dá)性差等問題。本文提出：如果能在腫瘤所在器官（肺）原位把巨噬細(xì)胞改造成CAR-M，就能避開這些問題并提升治療效果。

實(shí)驗(yàn)方案

1.sEV 設(shè)計(jì)與制備

構(gòu)建表達(dá)mesothelin（MSLN）特異性 CAR 的 mRNA（CAR^{mRNA}）；并將其裝載進(jìn)工程化的小型細(xì)胞外囊泡（sEV）。

在sEV 表面整合 anti-CD206 scFv（記作 aCD206）以靶向 M2 型巨噬細(xì)胞，并通過額外修飾（如 L7Ae/C-box 模塊、Cx43 修改等）提高 mRNA 裝載與遞送效率。對 sEV 的形貌（TEM）、蛋白標(biāo)志（CD63、TSG101 等）和 mRNA 含量做了表征。

2.體外驗(yàn)證（巨噬細(xì)胞培養(yǎng)與功能驗(yàn)證）

用骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDMs）極化成 M2 型后，檢測 sEV 的攝取（internalization）、CAR mRNA 的翻譯（用 EGFP 替換 CAR 作示蹤）、以及 CAR 蛋白的表達(dá)（流式/免疫熒光/Western blot）。

評估CAR-M 的功能性：對靶細(xì)胞（B16 小鼠黑色素瘤細(xì)胞構(gòu)建的 MSLN 表達(dá)系）進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子釋放檢測等。

3.免疫細(xì)胞互作與轉(zhuǎn)錄/信號通路檢測

用Transwell 共培養(yǎng)（sEV 處理后的 BMDM 在下室，T 細(xì)胞或 DC 在上室）評估 CAR-M 對 T 細(xì)胞增殖、DC 成熟等的旁分泌/抗原呈遞影響（用 CFSE 標(biāo)記 T 細(xì)胞，流式分析）。同時(shí)用 qPCR / heatmap / western blot 檢測吞噬后上調(diào)的信號通路（如 AKT、NF-κB、ERK）。

4.體內(nèi)給藥與抗腫瘤療效

在小鼠肺轉(zhuǎn)移模型中比較吸入（inhalation）與靜脈注射兩種給藥方式的組織分布（Fluc 或 DiR 示蹤）、巨噬細(xì)胞中 CAR 表達(dá)、腫瘤生長（生物發(fā)光、病理切片）、腫瘤微環(huán)境（流式細(xì)胞譜系分析、細(xì)胞因子測定）和長期復(fù)發(fā)/生存率。

CAR^mRNA@aCD206 sEVs制備過程示意圖

CAR^mRNA@aCD206在肺轉(zhuǎn)移癌中的靶向遞送及抗腫瘤機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.sEV 能有效加載并攜帶 CAR mRNA，工程化sEV 在形貌、表面標(biāo)志與 mRNA 含量上得到良好驗(yàn)證。

2.體外：aCD206-修飾的 sEV 更易被 M2 BMDM 攝取，能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生 CAR（EGFP 示例證明翻譯），并使巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗原特異性吞噬、釋放更多促炎細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α），在體外對 MSLN 陽性腫瘤細(xì)胞的吞噬與細(xì)胞毒性更強(qiáng)。

3.免疫互作：在Transwell 共培養(yǎng)中，CAR-M 能通過旁分泌或抗原遞呈促進(jìn) T 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo) DC 成熟（Transwell 里上室的 CFSE-標(biāo)記 T 細(xì)胞與 DC 的指標(biāo)顯示出明顯提升），提示 CAR-M 有助于激活適應(yīng)性免疫并可能引起“表位擴(kuò)展”。

4.體內(nèi)：吸入給藥相比靜脈注射能使sEV 在肺中更高富集并更有效地在肺巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo) CAR 表達(dá)（流式與組織免疫熒光證明）。吸入CAR^mRNA@aCD206 sEVs能顯著抑制肺轉(zhuǎn)移瘤負(fù)荷（生物發(fā)光、肉眼/HE切片），延長動物生存，并產(chǎn)生長期免疫記憶，同時(shí)肝臟富集問題明顯緩解。

討論

通過將CAR^mRNA 遞送到腫瘤組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞，可在不進(jìn)行復(fù)雜體外細(xì)胞制造的情況下產(chǎn)生功能性CAR-M，從而優(yōu)化生物分布、增強(qiáng)局部抗腫瘤免疫，并減少系統(tǒng)性副作用。

該技術(shù)在肺轉(zhuǎn)移模型上效果顯著，并顯示可誘導(dǎo)長期免疫記憶以預(yù)防復(fù)發(fā)。作者認(rèn)為該sEV 平臺具有推廣到其他靶抗原和組織的潛力，但要注意提升 mRNA 載入效率、特異性靶向以及臨床轉(zhuǎn)化中的劑量和安全性評估。

論文中用到的NEST產(chǎn)品

細(xì)胞小室

使用到的NEST產(chǎn)品：細(xì)胞小室

1.T 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

研究人員把CFSE 標(biāo)記的 T 細(xì)胞放在 Transwell 上室，把巨噬細(xì)胞（BMDM/CAR-M）放在下室，檢測是否能通過分泌因子促進(jìn) T 細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示：CAR-M 顯著增強(qiáng)了 T 細(xì)胞的增殖能力。

2.樹突狀細(xì)胞成熟實(shí)驗(yàn)

將未成熟DC放在上室，巨噬細(xì)胞放在下室，共培養(yǎng)后檢測 DC 的成熟標(biāo)志物。結(jié)果顯示：CAR-M 能有效促進(jìn) DC 成熟，增強(qiáng)免疫激活作用。

經(jīng)過與B16-MSLN 細(xì)胞共孵育預(yù)處理后的 M2 型 BMDM，在 Transwell 實(shí)驗(yàn)中對 T 細(xì)胞增殖的影響

G 經(jīng)過與 B16-MSLN 細(xì)胞共孵育預(yù)處理后的 M2 型 BMDM，在 Transwell 實(shí)驗(yàn)中對樹突狀細(xì)胞（DC）成熟（CD11c?CD80?CD86?）的影響

NEST細(xì)胞小室的優(yōu)勢

細(xì)胞小室在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中很常用，如：共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、趨化實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。其中，通透性支持物可以有效改善極性細(xì)胞的培養(yǎng)，因?yàn)檫@些支持物允許細(xì)胞從其基底面和頂面分泌和吸收分子，從而以更為自然的方式進(jìn)行代謝，最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境以培養(yǎng)某些特殊的細(xì)胞系。